基因克隆技術論文

　　基因克隆技術給人類生活帶來美好的前景，故寄予了無限的期望。下面是小編整理了，有興趣的親可以來閱讀一下!

　　篇一

　　差異表達基因克隆技術的新進展

　　　提要 分離並克隆差異表達基因是 目前 功能性基因 研究 的熱點。mRNA差異展示是篩選差異表達基因最有效的技術之一，它的主要不足是有一定假陽性。RDA、SSH、DSD、LSH技術能夠克服假陽性，但也具有一定的不足，應根據需要選擇運用。隨著能擴增長片段及具有自動校正功能的Taq酶出現及 應用 ，這些技術將會不斷完善與 發展 ，具有廣闊的應用前景。

　　關鍵詞 差異表達基因;克隆

　　現代 分子生物學研究表明，人類基因組約由10萬左右的不同基因組成，這些基因選擇性的表達決定了機體整個生命過程，基因表達的變化處於控制生物學調節機制的中心位置。因此，分離並克隆差異表達基因不僅有助於闡明生命的粵祕，而且還能為基因診斷與 治療 提供重要的 理論 依據。近幾年來，差異表達基因克隆技術不斷完善與發展，已成為研究腫瘤和疾病等相關基因的重要手段。

　　一、mRNA差異展示

　　mRNA差異展示***mRNA differential display,DDRT-PCR***是目前篩選差異表達基因最有效的 方法 之一，其基本原理是：3´端採用錨定引物，與mRNA3´poly a結合，進行反轉錄，形成mRNA：cDNA雜交分子，5´端採用20條隨機引物，與錨定引物一起進行PCR擴增，其產物經測序膠顯示出來，再回收鑑定克隆差異條帶。1992年Liang和Pardee[1]建立此技術時，5´端採用20條隨機引物，每條由10個鹼基組成，3´端採用12條引物即T12MN***M=A、C或G，N=A、G、C、T***。這種組合從統計學上幾乎能完全覆蓋所有的mRNA序列，差異表達的基因會全部呈現出來。實踐證明，這種方法有效，但假陽性率在50%～70%左右，差異條帶在Northern印跡上重現性差，後續處理也比較複雜。1994年Ito[2]等對3´端引物進行了改進，把12條引物改為3條，即T12A、T12C、T12G，使得實驗操作簡化。1995年Ayala[3]等提出了在3´端錨定引物與5´端隨機引物上皆增加10個鹼基，使得上下游引物Tm值在60℃左右，PCR迴圈引數也改為前5個迴圈採用Liang和Pardee推薦的引數，即94℃30s，40℃2min,72℃30s。經這樣改進，顯著地增強了差異條帶的重複性和敏感性，同時使得差異條逼帶的克隆十分方便。1996年4月，Liang和Pardee[4]對5´端此物進行了改進，引物條數改為8條，皆帶上HindⅢ酶切位點，每條由13個鹼基組成，3´端錨定引物採用3條，也帶上HindⅢ酶切位點，每條由18個鹼基組成，PCR迴圈條件仍採用94℃30s,40℃2min,72℃30s,40個迴圈，最後在72℃延伸7min。1998年[5]我們在Liang和Pardee改進的基礎上，對PCR迴圈引數進行了改進，即前5個迴圈採用94℃30s,40℃2min,72℃30s,後35個迴圈採用94℃30s,55℃2min,72℃30s，最後在72℃延伸7min。經這樣改進，既保持了擴增效率，又增強了差異條帶的特異性及重複性，降低了假陽性率。

　　總之，mRNA差異展示具有簡便、快速、所需起始材料少、同時可在多個材料之間或不同處理材料之間進行比較等優點，但具有較高頻率的假陽性和短小的差異片段的缺點，給後續處理帶來一系列 問題 ，雖然此技術經過了一些起改進，但這兩個缺點仍限制著此方法的充分應用。

　　二、代表性差示 分析

　　代表性差示分析***representational difference analysis,RDA***最早由Lisitsyn等提出的。1994年，Hubank和Schatz[6]將其應用於克隆差異表達基因，其基本原理是：靶方***Tester,T***和驅動方***Driver,D***的cDNA在進行差方式分析前均用一種識別4鹼基序列的限制酶作切割處理，形成平均長度為256bp的cDNA片段代表群，第一次T與D雜交反應時，兩者總量比為1：100，第二次增加到1：400，第三次增加到1：8000，再利用PCR以指數形式擴增雙鏈模板，而僅以線性形式擴增單鏈模板這一特性，通過降低cDNA群體複雜度和多次更換cDNA兩端接頭，來特異擴增目的基因片段。特別是T減D雜交反應後僅設定了72℃ 復性與延伸及95℃變性這兩個迴圈引數，共20個迴圈，從而使PCR產物特異性大大提高。此技術最大的優勢是差異條帶在Northern印跡上重現性好，假陽性少。缺點是所需起始材料較多，更多信賴於PCR技術，T與D之間若存在較多差異，或T中存在某些基因上調錶達，則難達到預期目的，而且工作量比DDRT-PCR大，週期長。

　　三、抑制性扣除雜交

　　抑制性扣除雜交***suppression subtractive hybridization,SSH***，是1996年Diatchenk[7]等提出的一種新的克隆基因技術，其基本原理是：先將T與D方cDNA用限制酶切割為小片段，將T方平均分為兩份，分別連線不同的接頭，然後與過量的D方cDNA進行不充分雜交。根據復性動力學原理，濃度高的單鏈分子迅速復發，而濃度低的單鏈分子仍以單鏈形式存在。然後混合兩份雜交樣品，同時加入新的變性D方cDNA進行第二次扣除雜交，雜交完全後補平末端，加入合適引物接頭***接頭1與接頭2引物***進行PCR擴增。當DNA兩條鏈含相同接頭時，其PCR擴增受到抑制，而含不同接頭的雙鏈DNA分子才可進行指數擴增，其產物即為目的片段。

　　此技術避免了消減雜交過程中分離單雙鏈DNA的步驟，可成千倍地擴增目的片段，能分離出T方上調錶達的基因，與DDRT-PCR相比，具有假陽性少重複性強的優點，它的最大不足就是需要較多的起始材料，更多依賴於PCR技術，不能同時進行數個材料之間或不同處理材料之間的比較。

　　四、差異消減展示

　　差異消減展示***differential subtraction display,DSD***是1998年Jose等[8]提出的，它是在DDTR-PCR呈現出差異條帶之後，同時回收差異條帶與對照方的相應範圍的條帶，靶方回收的差異條帶用非生物素標記的引物與dNTPs進行PCR擴增，而對照方回收的差異條帶用含生物素標記的dATP的dNTPs進行PCR擴增，其產物進行消減雜交，用鏈親和素去除共有的產物，剩下的產物由帶有α-32P dATP的dNTPs進行擴增，再重複差異展示，回收差異條帶並克隆。此技術最大的優勢是獲得差異條帶在Northern印跡上重現性好，假陽性少，敏感性強，可獲得長片段，起始材料要求少，可獲取低丰度差異表達基因，缺點是步驟繁瑣，工作量大，週期性長，更多依賴於PCR技術。

　　另外，趙忠良博士把長片段PCR擴增***LPCR***與消並減雜交技術結合起來，建立了LPS技術，並運用此技術從抗原呈細胞中獲取了170多個差異表達基因。此技術的基因原理是：T與D方分離出cDNA後，運用5´端帽子引物與3´端錨定引物，對cDNA進行大量擴增，其產物直接進行消減雜交，然後過柱子，去除相同的基因，剩餘的部分再與D方cDNA進行二輪消減雜交，再過柱子，去除非差異部分，剩下的差異部分進行第三輪消減雜交，其產物進行分級分段克隆。這種 方法 最大的好處是：起始材料需要少，可獲得差異基因，假陽性少，有可能獲得全長差異表達基因。

　　總之，隨著高效擴增的Taq酶與具有自動校正功能的Taq酶的出現，長片段PCR擴增技術的優化，差異表達基因克隆技術將會不斷 發展 ，但 目前 主要有以上幾種方法，各有其優缺點， 研究 者應根據自己的實際情況，選擇合適的技術方法，以其達到自己預期的目的。

　　參考 文獻

　　1 Liang P et al.Science,1992:257***14***:967

　　2 Ito T et al.FEBS letters,1994;351:231

　　3 Ayala M et al.Biotechniques,1995;18***5***:842

　　4 GenHunter Corporation,RNA imageTM,kit***cat NO.G501*** for mRNA diflerential& nbsp;display,1996,April,12

　　5 Cui DX et al.Journal of the Fourth Military university,1998;18***6***:601

　　6 Hubank M et al.NuclEic Acids Res,1994;22:5640

　　7 Diatchenko L et al.Proc Natl Sci USA,1996;93:6025

　　8 Jose RP et al.Analytical Biochemistry,1998;257:161

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