隨著社會的進步，生物資訊科技越來越發達，大家想了解三代測序PacBio RS平臺資料嗎？不妨來看一下吧。
方法/步驟
平臺簡介:
第三代基因測序技術又被為"Single Molecule Real Time (SMRT) DNA Sequencing"（單分子實時DNA測序技術），該方法基於納米孔的單分子讀取技術，不需要擴增即可快速讀取序列。目前，Pacific Biosciences公司已經成功推出了商業化的第三代測序儀PacBio RS平臺，使得第三代測序正式走入人們的視角。
PacBio RS II是Pacific Biosciences公司研發的單分子實時測序系統（Single Molecule Real Time, SMRT），其專利的SMRT Cell含有15,000個納米級的零模波導孔（zero-mode waveguides, ZMWs），每個ZMW都能夠包含一個DNA聚合酶及一條DNA樣品鏈進行單分子測序，並實時檢測插入鹼基的熒光訊號。
技術特點
ü 利用測序過程聚合酶反應的動力學變化，首次實現對鹼基修飾進行直接測序。
ü 超長的讀長：平均測序讀長能達到7,000-8,000bp，最長讀長能達到3,0000bp；
ü 準確率高：對基因組組裝和基因組變異檢測，可以最多達到99.999%的準確率；
ü 敏感性強：可以檢測頻率在0.1%的minor variants；
ü 無PCR擴增偏好性：樣本不需要進行PCR擴增，避免了覆蓋度不均一和PCR artifacts；
ü 最小的GC偏好性（GC bias）：在極端高GC和極端低GC區域，可以輕鬆測定，從而保證序列的均勻覆蓋度。
資料產出
試劑盒 平均讀長 資料量/SMRT Cell
P4-C2 Chemistry 5.5-6Kb ~200Mb
P5-C3 Chemistry 8-10Kb ~250Mb
應用領域
（1）全基因組de novo測序
與二代測序最高不超過1kb的讀長相比，PacBio RS II的長讀長將有效解決短序列資料的拼接難題。同時，與二代測序的模板樣品需要擴增相比，PacBio RS II無需擴增可直接對單個分子進行測序，有效避免了PCR擴增偏好性和GC偏好性，PacBio RS II可輕鬆跨越GC含量異常（過高或過低）及高度序列重複的區域，實現序列覆蓋的完整性和均一性。
（2）基因組草圖的優化或基因組完成圖繪製
對前期已開展測序的動植物、微生物基因組結合三代長讀長測序資料進行完善和提升。針對前期已經開展全基因組測序，獲得基因組草圖的動植物、微生物等，可以結合PacBio RS II平臺長讀長reads進行補充，從而快速獲得前期沒有測得的資訊及提升基因組的完整度。另外還可以針對前期沒有檢測獲得的結構變異資訊（structural-variation events）、串聯重複序列資訊（tandem duplication）、易位資訊（Inversion）等。尤其在微生物基因組完成圖的繪製中，可在一天之內、成本低於$1,000即可將基因組完善獲得0 gap contig。
（3）全長轉錄本測序
PacBio RS II的長讀長可實現全長轉錄本測序，並使基因可變剪接形式的識別成為可能，因此可以對新基因及其isoform進行更全面的研究。同時，長讀長不再需要對RNA-Seq的reads進行組裝，因此可以更完整的對基因模型和轉錄的基因進行更全面的註釋，用以改進參考基因組中的基因註釋資訊。
（4）巨集基因組測序
長讀長reads能夠更為精準地鑑定水體、土壤、腸道等生境中微生物的種類的鑑定，能夠更加快捷地獲得更多微生物種的全基因組序列。
（5）16S rDNA全長測序
PacBio RS II的平均讀長為8-10Kb，而16S rDNA長度大約為1540bp，因此結合該平臺測序可以成功測序獲得16S的全長序列。
（6）細胞器基因組測序
葉綠體基因組和線粒體基因組序列都包含重複序列、反向重複序列等複雜結構，PacBio RS II的長讀長可直接跨越這些區域獲得這些細胞器的全基因組序列資訊等，基因組組裝不依賴於是否有近緣物種的線粒體和葉綠體基因組資訊等、重測序能夠檢測到全面的SNPs及indel資訊。
（7）全基因組重測序&稀有變異鑑定
PacBio RS II長讀長測序reads無GC偏號，能夠全面獲得基因組的遺傳變異，包括SNPs的鑑定到CNV、SV結構變異等，可運用至人類癌症基因組重測序等。PacBio RS II平臺測序週期在10 hours小時即可完成測序，可應用至需要快速反饋的臨床檢測中，如細菌感染疾病中細菌的鑑定、病毒的鑑定等，取樣開展重測序和目前已有的細菌、病毒基因組資料庫進行比對鑑定即可。
（8）表觀遺傳學
PacBio RS II利用測序過程聚合酶反應的動力學變化，首次實現對鹼基修飾進行直接測序。當鹼基有額外修飾時，DNA聚合酶的合成速度會減慢，對應的訊號會被檢測出來。每種鹼基修飾事件都會使聚合酶的“停頓模式”PacBio RS II產生微小差異，最終反映到熒光脈衝訊號的間隔上。除了甲基化修飾，還可以檢測5-hC、5-hmU、5-hU、1-mA、6-mA、8-oxoA、BPDE、6-mT、6-mG等鹼基修飾，甚至可以鑑別傳統亞硫酸氫鹽測序法無法區分的甲基化修飾和羥甲基化修飾。PacBio平臺可以在測序的同時即可檢測表觀遺傳學修飾資訊，只需對測序資料選擇合適的軟體即可分析鹼基修飾資訊。
第一代測序技術-Sanger鏈終止法
一代測序技術是20世紀70年代中期由Fred Sanger及其同事首先發明。其基本原理是，聚丙烯醯胺凝膠電泳能夠把長度只差一個核苷酸的單鏈DNA分子區分開來。一代測序實驗的起始材料是均一的單鏈DNA分子。第一步是短寡聚核苷酸在每個分子的相同位置上退火，然後該寡聚核苷酸就充當引物來合成與模板互補的新的DNA鏈。用雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑（雙脫氧核苷酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需要的3－OH基團，所以可被用作鏈終止試劑）通過聚合酶的引物延伸產生一系列大小不同的分子後再進行分離的方法。測序引物與單鏈DNA模板分子結合後，DNA聚合酶用dNTP延伸引物。延伸反應分四組進行，每一組分別用四種ddNTP（雙脫氧核苷酸）中的一種來進行終止，再用PAGE分析四組樣品。從得到的PAGE膠上可以讀出我們需要的序列。
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第二代測序技術-大規模平行測序
大規模平行測序平臺（massively parallel DNA sequencing platform）的出現不僅令DNA測序費用降到了以前的百分之一，還讓基因組測序這項以前專屬於大型測序中心的“特權”能夠被眾多研究人員分享。新一代DNA測序技術有助於人們以更低廉的價格，更全面、更深入地分析基因組、轉錄組及蛋白質之間互動作用組的各項資料。市面上出現了很多新一代測序儀產品，例如美國Roche Applied Science公司的454基因組測序儀、美國Illumina公司和英國Solexa technology公司合作開發的Illumina測序儀、美國Applied Biosystems公司的SOLiD測序儀。Illumina/Solexa Genome Analyzer測序的基本原理是邊合成邊測序。在Sanger等測序方法的基礎上，通過技術創新，用不同顏色的熒游標記四種不同的dNTP，當DNA聚合酶合成互補鏈時，每新增一種dNTP就會釋放出不同的熒光，根據捕捉的熒光訊號並經過特定的計算機軟體處理，從而獲得待測DNA的序列資訊。以Illumina測序儀說明二代測序的一般流程，（1）文庫製備，將DNA用霧化或超聲波隨機片段化成幾百鹼基或更短的小片段。用聚合酶和外切核酸酶把DNA片段切成平末端，緊接著磷酸化並增加一個核苷酸黏性末端。然後將Illumina測序接頭與片段連線。（2）簇的建立，將模板分子加入晶片用於產生克隆簇和測序迴圈。晶片有8個縱向泳道的矽基片。每個泳道內晶片表面有無數的被固定的單鏈接頭。上述步驟得到的帶接頭的DNA 片段變性成單鏈後與測序通道上的接頭引物結合形成橋狀結構，以供後續的預擴增使用。通過不斷迴圈獲得上百萬條成簇分佈的雙鏈待測片段。（3）測序，分三步：DNA聚合酶結合熒光可逆終止子，熒游標記簇成像，在下一個迴圈開始前將結合的核苷酸剪下並分解。（4）資料分析
第三代測序技術-高通量、單分子測序
被稱為第三代的測序的He-licos單分子測序儀，PacificBioscience的SMRT技術和
Oxford Nanopore Technologies 公司正在研究的納米孔單分子測序技術正向著高通量 低成本 長讀取長度的方向發展。不同於第二代測序依賴於DNA模板與固體表面相結合然後邊合成邊測序，第三代分子測序，不需要進行PCR擴增。（1）Helico BioScience 單分子測序技術。該測序是基於邊合成邊測序的思想，將待測序列隨機打斷成小分子片段並用末端轉移酶在 3' 末端加上 poly(A),以及在poly(A)的末端進行熒游標記和阻斷，把這些小片段與帶有poly(T)的平板雜交成像來獲得已經雜交模板所處的位置，建立邊合成邊測序的位點加入聚合酶和被Cy3熒游標記脫氧核苷酸進行DNA 合成，每次只加入一種脫氧核苷酸，然後將未參與合成的dNTP和DNA聚合酶洗脫，直接對Cy3成像，觀測模板位點上是否有熒光訊號，然後化學裂解核苷酸上的燃料並釋放加入下一種脫氧核苷酸和聚合酶的混合物，進行下一輪反應。（2）Pacific BioscienceSMRTT技術。該測序也是基於邊合成邊測序的原理，這項技於使用了Zero-ModeWaveguide(ZMW)(零級波導)。測序的過程：被熒游標記磷酸集團的核苷酸在聚合酶活性位點上與模板鏈結合（每種脫氧核苷酸被不用顏色的染料標記），被激發出熒光，在熒光脈衝結束後，被標記的磷酸集團被切割並釋放，聚合酶轉移到下一個位置，下一個脫氧核苷酸連線到位點上開始釋放熒光脈衝，進行下一個迴圈。（3）Oxford Nanopore Technologies 的納米孔單分子測序技術。大多數納米孔測序技術的基本原理是當DNA分子或者它的組成鹼基從一個孔洞經過時而檢測到被影響的電流或光訊號。OxfordNanopore 測序技術是以α- 溶血素來構建生物納米孔，核酸外切酶依附在孔一側的外表面，一種合成的環糊精做為感測器共價結合到納米孔的內表面。這個系統被鑲嵌在一個脂雙分子層內，為了提供既符合鹼基區分檢測又滿足外切酶活性的物理條件，脂雙分子層兩側為不同的鹽濃度在適合的電壓下，核酸外切酶消化單鏈 DNA，單個鹼基落入孔中，並與孔內的環糊精短暫的相互作用，影響了流過納米孔原本的電流，腺嘌呤與胸腺嘧啶的電訊號大小很相近，但胸腺嘧啶在環糊精停留是時間是其他核苷酸的2-3倍，所以每個鹼基都因其產生電流乾擾振幅是特有的而被區分開來