飼養細胞製備方法

　　飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明瞭，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長刺激因子，為雜交瘤細胞提供必要的生長條件。下面是小編精心為你整理的，一起來看看。

　　1、小鼠***一般選取經產母鼠***脫頸椎致死，注意斷頸椎時儘量減少對腹腔的壓迫，避免損傷腹腔內血管，以防飼養細胞內含有大量血細胞。

　　2、將小鼠浸泡於75%酒精中5—10分鐘，然後手提住小鼠尾巴，上下於酒精中涮洗數次。置於超淨臺無菌平皿中。

　　3.用無菌剪鑷從後腹剪開面板，沿兩側剪開面板，暴露腹部，注意不要損傷腹膜。用酒精棉球擦拭腹膜。

　　4.用注射器吸取6-8ml的不完全培養基注射入腹腔，注意注射時用鑷子提起腹膜，避免針頭刺到腸管等腹腔臟器。

　　5.用棉球輕輕按摩腹部一分鐘，吸出注入的培養液。

　　6.800-1000 r/min離心5-10 min，棄去上清。若腹腔血管損傷，沉澱中可見有紅細胞。

　　7.用5mlHAT培養基懸浮細胞根據細胞計數結果，補加HAT培養基，使細胞濃度達2×105/ml。***一般情況下一隻經產母鼠可鋪2-3塊96孔板。***

　　通對巨噬細胞來說，96孔板每孔需要2×104個細胞，24孔板需105個細胞。每隻小鼠課的3-5×106個細胞，因此一隻小鼠可供兩塊96孔板飼養細胞。

　　8.將上述細胞懸液加入96孔板，每孔0.1ml,37℃,6% CO2的培養箱培養。

　　單克隆抗體飼養細胞的製備

　　小鼠腹腔細胞含有巨噬細胞，除具有飼養作用外，還可清除死亡破碎細胞及微生物。取8～10周齡同系小鼠，斷頸處死後，無菌操作腹腔內注射10～15ml完全培養液，用消毒拇指輕揉腹部數次後， 吸回腹腔液體，調整細胞濃度為1×105/ml。 一般一隻小鼠腹腔液可獲取細胞3～5×106，可供一次融合用。亦可取兩隻小鼠腹腔巨噬細胞混合使用。此外，同系小鼠脾細胞和胸腺細胞亦可作為飼養細胞。

　　選擇性培養 兩種親本細胞經PEG處理後，可形成多種細胞成分的混合體，包括未融合的遊離親本細胞、骨髓瘤細胞間的融合、免疫B細胞間的融合以及骨髓瘤細胞與免疫B細胞間融合的異核細胞，僅後者可形成雜交瘤，應予以篩選出來克隆培養。通常應用HAT培養液，其中含有次黃嘌呤H、氨基喋呤A和胸腺嘧啶核苷T。

　　大多數實驗室在融合當天就加入HAT培養液，也可次日加入。一般在融合後7～14天內使用HAT培養液，然後改用HT培養液。融合後第2～3周進行換液，每次吸出培養孔舊液1/2換入新液，以後視克隆生長情況3～5天換液1次，連續2周。3～5天后未融合及自身融合的細胞逐漸死亡，1周左右可出現克隆，並不斷增殖，當集落>3mm或佈滿孔底1/2時即可取上清作抗體活性檢測，同時補加新鮮HT培養液。在一次較好的融合試驗中，約70～80%孔有克隆生長。所有生長克隆的孔都需要取培養上清液進行抗體活性檢測。培養3周後即可改用普通完全培養液。