肺結核病人皰疹病毒感染的檢測和臨床意義

General 更新 2024年12月23日
                        作者:紀靜 許俊華 徐翮飛 羅兵

【摘要】  目的 探討肺結核病人皰疹病毒活動性感染情況。方法 採用酶聯免疫吸附試驗***ELISA***,檢測62例肺結核病人和43例正常對照者血清中人鉅細胞病毒(HCMV)和單純皰疹病毒(HSV)特異性IgM抗體以及EB病毒(EBV)衣殼抗原(VCA)IgM抗體。 同時,採用PCR?Southern檢測肺結核病人和正常人外周血單個核細胞中EBV DNA表達。結果 肺結核組血清HCMV?IgM和HSV?IgM陽性率分別為19.4%和12.9%,正常對照組分別為4.7% 和0,肺結核組HCMV?IgM和HSV?IgM陽性率均高於正常對照組***χ2=4.75、4.31,P<0.01***。肺結核組和正常對照組均未檢測到EB病毒VCA?IgM,肺結核組EBV DNA陽性率(48.4%)高於正常對照組(4.7%),差異有顯著性***χ2=22.92,P<0.01***。繼發性肺結核皰疹病毒感染率(39.6%***高於原發性肺結核(7.1%***,差異有顯著性 ***χ2=3.84,P<0.05***。結論 部分肺結核病人存在HCMV、HSV以及EBV的活動性感染,人皰疹病毒感染可能影響肺結核病情發生發展。 
【關鍵詞】  單純皰疹病毒屬;結核,肺;酶聯免疫吸附測定

  [ABSTRACT]ObjectiveTo explore the active infection of human herpesvirus in patients with tuberculosis ***TB***.Me?thodsThe specific IgM antibodies against human cytomegalovirus ***HCMV***, herpes simplex virus (HSV) and VCA of Epstein?Barr virus (EBV) in serum of 62 TB patients and 43 normal controls were detected by ELISA, and the expression of EBV DNA in mononuclear cells in peripheral blood of both groups by PCR?Southern.ResultsThe positive rates of anti?HCMV and anti?HSV IgM in the patients were 19.4% and 12.90%, respectively,and that in the control groups were 4.7% and 0. The positive HCMV?IgM and HSV?IgM in the patients were higher than that in the controls ***χ2=4.75,4.31;P<0.01***. However, VCA?IgM of EBV was not detected in both groups. The positive rate of EBV?DNA in the patients ***48.4%*** was significantly higher than that of the controls ***4.7%,χ2=22.92,P<0.01***. The infection of herpesvirus was higher in secondary TB ***39.6%*** than primary ***7.1%***, the difference was significant ***χ2=3.84,P<0.05***.ConclusionActive infection of HCMV,HSV and EBV exists in some TB patients,which suggests that human herpesvirus infection might impact the pathogenesis of TB.
    
  [KEY WORDS]Simplexvirus; Tuberculosis, pulmonary; Enzyme linked immunosorbent assay
    結核病的發病率近年來有增加趨勢,嚴重危害人類健康,我國每年約有25萬人死於各種結核病,位居各類傳染病之首,結核病再次成為迫切需要解決的公共衛生問題。結核病病人尤其是重症病人常併發病毒感染,進而可引起難治性結核。人皰疹病毒在人群中具有較高的感染率,通常表現為潛伏感染,當機體抵抗力下降時可引起啟用感染。本研究採集62例肺結核病人的血清,檢測人鉅細胞病毒(HCMV)?IgM、單純皰疹病毒(HSV)?IgM和EB病毒衣殼抗原(VCA)?IgM抗體及外周血單個核細胞(PBMC)EBV DNA表達,瞭解肺結核病人皰疹病毒的感染狀態,現報告如下。
  1  資料與方法
  1.1  一般資料
    本文62例肺結核病人為2006年7~12月在青島市胸科醫院呼吸科門診就診及住院病人,男36例,女26例;年齡15~85歲,平均50歲。診斷均符合世界衛生組織結核病會議修訂的診斷標準[1]。其中原發性肺結核14例,繼發性肺結核48例。正常對照組43例,來自健康查體人群,年齡和性別與肺結核組相匹配。
  1.2  特異性IgM抗體的檢測
    採集正常對照組和肺結核病人外周血,分離血清,採用ELISA法檢測HCMV?IgM、HSV?IgM和VCA?IgM 抗體,ELISA檢測試劑盒購自德國9VATEC公司。HSV抗體檢測試劑盒不分型別,參照試劑盒說明書進行操作,對陽性和可疑陽性標本進行重複檢驗。
  1.3  EBV DNA的檢測
  1.3.1  DNA樣本製備 
  採集正常對照組和肺結核病人的外周靜脈血,EDTA抗凝,分離PBMC,酚?氯仿?異戊醇法常規提取細胞DNA,預冷無水乙醇沉澱核酸,自然乾燥後用TE緩衝液(pH 8.0)溶解DNA,4 ℃ 儲存備用。
  1.3.2  PCR?Southern 
  參照文獻[2]方法,選用EBV BamHⅠ?W 區特異性引物和探針,對提取細胞DNA 進行檢測,上游引物序列為: 5′?CCAGACAGCAGCCAATTGTC?3′,下游引物序列為: 5′?GGTAGAAGACCCCCTCTTAC ?3′,探針序列為:5′?CCCTGGTATAAAGTGGTCCTGCAGCTATT?TCTGGTCGCATC?3′。PCR反應總體積為25 μL,反應體系為:10×Buffer 2.5 μL,MgCl2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,上下游引物各0.5μmol/L, Taq DNA 聚合酶1.0 U,DNA 模板3 μL,同時設立陽性對照和陰性對照。陽性對照為EBV陽性的B95?8細胞,陰性對照為EBV陰性細胞系Ramos細胞。擴增條件為:94 ℃預變性5 min;然後94 ℃ 30 s, 55℃ 30 s, 72 ℃ 45 s,擴增35個迴圈;最後72 ℃延伸5 min。取擴增產物10 μL 以20 g/ L 瓊脂糖凝膠電泳後轉印到尼龍膜上,與地高辛標記的寡核苷酸探針進行雜交反應,經鹼性磷酸酶標記的抗地高辛抗體作用後,加酶的發光底物CSPD 作用5 min,自顯影檢測雜交訊號。
  1.4  統計學處理
    採用四格表χ2檢驗進行統計學處理。
  2  結 果
  2.1  特異性IgM抗體檢測
    肺結核組HCMV?IgM陽性率高於正常對照組,差異有顯著性***χ2=4.75,P<0.05***;HSV?IgM抗體陽性率也高於正常對照組,差異有顯著性(校正χ2=4.31,P<0.05);但肺結核組與正常對照組VCA?IgM 抗體均為陰性。見表1。 表1  肺結核組與正常對照組血清3種皰疹病毒特異性IgM抗體陽性率比較(略)
  2.2  不同型肺結核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗體檢測
    原發性肺結核14例中HCMV?IgM 陽性1例,陽性率為7.1% ;繼發性肺結核48例中HCMV?IgM 陽性11例,HSV?IgM陽性8例,陽性率為   
39.6%。繼發性肺結核與原發性肺結核兩種皰疹病毒抗體IgM檢出陽性率比較差異有顯著性(χ2=3.84,P<0.05)。
  2.3  EBV DNA檢測
    肺結核組EBV DNA陽性率為48.4%(30/62),正常對照組EBV DNA陽性率為4.7%***2/43***,肺結核組EBV DNA陽性率明顯高於正常對照組,差異有顯著性***χ2=22.92,P<0.01***。
  3  討 論
    皰疹病毒屬DNA病毒,在我國人群中感染非常普遍,通常為潛伏感染,不引起臨床症狀,但在一定條件下可啟用。 與人類疾病有關的皰疹病毒有8 型,依次為單純皰疹病毒1 型及2型(HSV?1、HSV?2)、水痘?帶狀皰疹病毒、Epstein?Barr病毒(EBV)、HCMV、人類皰疹病毒6型(HHV?6)、人類皰疹病毒7型(HHV?7)型和人類皰疹病毒8型(HHV?8)[3]。目前世界範圍內肺結核發病率呈升高趨勢,肺結核病人尤其是重症肺結核病人若併發皰疹病毒感染,易造成診斷困難,病情複雜化以及療效差等。本文對青島地區肺結核病人皰疹病毒的感染情況進行了初步研究。
    血清特異性IgM抗體出現或效價升高被認為是病毒早期感染和潛伏病毒啟用的標誌之一。本文研究結果顯示,肺結核病人血清HCMV?IgM和HSV?IgM抗體陽性率明顯高於正常對照組,提示肺結核病人存在HCMV和 HSV的活動性感染。SKRIAGINA等[4]檢測了44例急性發作期肺結核病人血清,結果證實肺結核病人存在HSV的機會性感染。很多文獻已經證實,在機體免疫功能低下時常誘發皰疹病毒的活動性感染,肺結核病人多伴有細胞免疫功能紊亂,可導致潛伏感染狀態的病毒啟用,而活動性病毒感染又可促使結核菌活動,進而影響肺結核病人病情發生發展。免疫缺陷者分支桿菌感染概率明顯增加,發生結核病的概率較正常人高得多。有文獻報道,HCMV感染可引起短時間免疫缺陷,而免疫缺陷亦易引起HCMV感染[5]。 SIRENKO等[6]對65例肺結核病人的研究顯示,與病情穩定的肺結核病人比較,病情複雜的肺結核病人皰疹病毒IgM抗體檢出率顯著增高,提示鉅細胞病毒感染可能影響肺結核的發生及病情進展。本文研究結果表明,繼發性肺結核病人HCMV和 HSV活動性感染率明顯高於原發性肺結核。
    VCA?IgM是EBV原發感染的標誌,其在活動性感染中是否陽性目前尚無定論。有研究認為,VCA?IgM僅見於EBV的原發感染;個別研究發現啟用感染時,VCA?IgM陽性。本研究同時檢測VCA?IgM和EBV DNA,結果顯示,肺結核組和正常對照組血清均未檢測到VCA?IgM抗體, 支援VCA?IgM僅見於EBV原發感染的觀點;而肺結核病人EBV DNA的陽性率高於正常對照組, 提示可能存在潛伏EBV的啟用感染。因此,有必要對EBV DNA載量進行檢測,以進一步明確結核病人EBV 的感染狀況。
    
  皰疹病毒感染有潛伏感染和活動性感染兩種形式,潛伏感染時病毒以相對非活性狀態存在於細胞內,宿主細胞常常包含多個拷貝的病毒DNA,大部分保持遊離形式,部分能與宿主細胞基因組整合,在某些因素作用下病毒可由潛伏狀態轉變為活動狀態[7]。肺結核系慢性消耗性疾病,可導致機體免疫功能降低,作為肺結核非病因性的人皰疹病毒潛伏感染可被啟用,而皰疹病毒感染可能進一步導致免疫功能低下,從而影響病情進展。因此,對肺結核病人可檢查皰疹病毒活動性感染指標,對伴有活動性感染者在用抗結核藥物的同時使用抗皰疹病毒類藥物,可緩解病人病情,有利於病人康復。
【參考文獻】
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  [3]鍾江. 皰疹病毒科學研究進展[J]. 國外醫學:微生物學分冊, 2003,26(4):41?48.

  [4]SKRIAGINA E M, KOLOMIETS A G, GRITS M A, et al. Tuberculosis and opportunistic infection[J]. Probl Tuberk, 1999***6***:25?26.

  [5]DE LA HOZ RE, STEPHENS G, SHERLOCK C. Diagnosis and treatment approaches of CMV infection in adult patients[J]. J Clin Virol, 2002,25***Suppl 2***:S1?S12.

  [6]SIRENKO IA, SHMAT’KO S A, SMELIANSKAIA M V, et al. Impact of cytomegalovirus infection on the course of tuberculosis in children and adolescents[J]. Probl Tuberk Bolezn Legk, 2003***8***:7?9.

  [7]何妙俠. EB病毒與T細胞淋巴瘤[J]. 診斷病理學雜誌, 1998,5***1***:43?46.

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