全基因組測序方法?

全基因組測序的技術路線

提取基因組DNA，然後隨機打斷，電泳回收所需長度的DNA片段（0.2~5Kb），加上接頭, 進行基因簇cluster製備或電子擴增E-PCR，最後利用Paired-End（Solexa）或者Mate-Pair（SOLiD）的方法對插入片段進行測序。然後對測得的序列組裝成Contig，通過Paired-End的距離可進一步組裝成Scaffold，進而可組裝成染色體等。組裝效果與測序深度與覆蓋度、測序質量等有關。常用的組裝有：SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。

一個物種的全基因組測序後，應該怎麼使用生物信息學方法對其進行研究

仿照別人的呀，整體描述測序情況，有趣的功能基因組分析，功能基因驗證

目前基因組測序最新的方法有哪些

目前已完成全基因組測序的物種主要可以分類三大類，模式物種、農作物和經濟作物、有藥用價值的物種。

在模式物種這塊，眾所周知的，擬南芥、果蠅、斑馬魚、小鼠、大鼠等等；

而農作物和經濟作物大概有以下：水稻、玉米、大豆、甘藍、白菜、高粱、黃瓜、西瓜、馬鈴薯、番茄、擬南芥、楊樹、麻風樹、蘋果、桃、葡萄、花生；

在藥用這塊，目前主要有一些真菌類，例如靈芝、茯苓等，以及一些藥用植物，例如丹蔘、長春花等。

有誰能詳細說一下全基因組Bisulfite Sequencing的流程

亞硫酸氫鈉測序法(bisulfite genomic sequencing)

直接測序法是建立在MSP基礎上進一步深入研究CpG島各個位點甲基化情況的方法。重亞硫酸鹽使DNA中未發生甲基化的胞嘧啶脫氨基轉變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變，行PCR擴增(引物設計時儘量避免有CpG，以免受甲基化因素的影響)所需片段，則尿嘧啶全部轉化成胸腺嘧啶。最後，對PCR產物進行測序，並且與未經處理的序列比較，判斷是否CpG位點發生甲基化。此方法一種可靠性及精確度很高的方法，能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化狀態。在尋找有意義的關鍵性CpG位點上，有其他方法無法比擬的優點。測序法以CpG島兩側不含CpG點的一段序列為引物配對區，所以能夠同時擴增出甲基化和非甲基化靶序列。它的不足是耗費時間和耗資過多，至少要測序10個以上的克隆才能獲得可靠數據，需要大量的克隆及質粒提取測序，過程較為繁瑣、昂貴。

第一部分 基因組DNA的提取。

這一步沒有懸念，完全可以購買供細胞或組織使用的DNA提取試劑盒，如果實驗室條件成熟，自己配試劑提取完全可以。DNA比較穩定，只要在操作中不要使用暴力，提出的基因組DNA應該是完整的。

此步重點在於DNA的純度，即減少或避免RNA、蛋白的汙染很重要。因此在提取過程中需使用蛋白酶K及RNA酶以去除兩者。

使用兩者的細節：

1：蛋白酶K可以使用滅菌雙蒸水配製成20mg/ml；

2：RNA酶必須要配製成不含DNA酶的RNA酶，即在購買市售RNA酶後進行再處理，配製成10mg/ml。否則可能的後果是不僅沒有RNA，連DNA也被消化了。兩者均於-20度保存。

驗證提取DNA的純度的方法有二：

1：紫外分光光度計計算OD比值；

2：1%-1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

我傾向於第二種方法，這種方法完全可以明確所提基因組DNA的純度，並根據Marker的上樣量估計其濃度，以用於下一步的修飾。

第二部分 亞硫酸氫鈉修飾基因組DNA

如不特別指出，所用雙蒸水（DDW）均經高壓蒸汽滅菌。

1：將約2ugDNA於1.5mlEP管中使用DDW稀釋至50ul；

2：加5.5ul新鮮配製的3M NaOH；

3： 42℃水浴30min；

水浴期間配製：

4：10mM對苯二酚（氫醌），加30ul至上述水浴後混合液中；（溶液變成淡黃色）

5： 3.6M亞硫酸氫鈉（Sigma，S9000），配製方法：1.88g亞硫酸氫鈉使用DDW稀釋，並以3M NaOH滴定溶液至PH 5.0，最終體積為5ml。這麼大濃度的亞硫酸氫鈉很難溶，但加入NaOH後會慢慢溶解，需要有耐心。PH一定要準確為5.0。加520ul至上述水浴後溶液中。

6：EP管外裹以鋁箔紙，避光，輕柔顛倒混勻溶液。

7：加200 ul 石蠟油，防止水分蒸發，限制氧化。

8：50℃避光水浴16h。

一般此步在4pm開始做，熟練的話不到5pm即可完成，水浴16h正好至次日8am以後收，時間上很合適。

這一步細節：

1：基因組DNA的量不需十分精確，寧多勿少，因為在以後純化回收步驟中會有丟失，且此方法修飾最多可至4ug。

2：所有試劑均須新鮮配製，所以配液的技術要過關，既要快，又要精確。

3：亞硫酸氫鈉溶液呈強酸性，一定用鹼將PH調製5.0，否則PH不合適會影響後續純化吸收。

4：水浴最好達16小時，雖可以短至8小時，但後者修飾會有不完全。

第三部分 修飾後DNA純化回收

EP管如無特別說明均為高壓蒸汽滅菌的。

1. 將移液器槍頭伸入石蠟油層下，先輕輕加壓使其中一小段石蠟油排出，然後吸取混合液至一潔......

全基因組測序需要多長時間？

真正全基因測序的信息數據了是很大的，檢測時間相對而言也會久一點。

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全基因組和全外顯子組測序的區別

基於第二代高通量測序技術，對於有參考序列的物種，針對不同的真菌菌株，可通過全基因組重測序的方法獲得全基因組範圍內完整的變異信息，討論群體的遺傳結構、影響群體遺傳平衡的因素以及物種形成的機制，定位重要性狀位點，為後續分子育種打下堅實基礎。同時，通過全基因組大樣本重測序對真菌重要菌株進行全基因組的基因型鑑定，並與關注的表型數據進行全基因組關聯分析（GWAS），找出與關注表型相關的SNP位點，定位性狀相關基因。隨著測序成本降低和擁有參考基因組序列的物種增多，基因組重測序也成為育種研究中迅速有效的方法之一，在全基因組水平掃描並檢測出與重要性狀相關的變異位點，具有重大的科研價值和產業價值。

近日，Nature Genetics發表的一篇文章就充分利用了微生物基因組測序與以全基因組重測序為基礎的全基因組關聯分析結合的方法，揭示了裂殖酵母遺傳與表型多樣性之間的聯繫。研究者選取裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe作為研究對象，在全球20個國家範圍內收集了時間跨度為100年的161個野生株系的S.Pombe，進行了全基因組測序，推測裂殖酵母在公元前340年開始廣泛大量出現，祖先種到達美洲的時間為公園1623年。後續研究者又選取223個菌種進行全基因組關聯分析，發現至少89個性狀表現出一個關聯。每個性狀最顯著的檢測到的變異可以解釋平均22%的表型差異，且indel的影響比SNP更大。