退火溫度怎麼確定?

退火溫度怎麼確定

轉變溫度Tg以下，一般採用低於Tg溫度50度吧，既然你都測得了轉變溫度360度，那你退火也就在320左右吧，沒有具體值，看應力消除效果。

pcr退火溫度怎麼確定

計算退火溫度的方法：

1. 退火溫度＝4×（G＋C）＋2×（A＋T）－（5～8） 只是粗算，有時不靈，但比較簡便。

2.用primer5（or oligo6）計算，引物配對好後，primer5可以顯示Tm，我認為這個值就是退火溫度，我的經驗再加2 or 3度最好。

3.合成引物的單子上也有個Tm，減去5～8也可，但有些公司提供的Tm就是方法1計算的。

再結晶退火溫度如何確定

開始生成新晶粒的溫度稱為開始再結晶溫度。

顯微組織全部被新晶粒所佔據的溫度稱為終了再結晶溫度或完全再結晶溫度。

常用的再結晶溫度是指塑性變形度達到70%的材料在保溫60min內，再結晶程度達到95%以上的最低溫度。

最低再結晶溫度=a*Tm（K）

工業純金屬a=0.35-0.4 ，高純金屬a=0.25-0.35甚至更低 。

其中：Tm-------金屬的熔點，K---------K氏溫度。

做pcr時退火溫度一般怎麼設置

在模板變性後溫度快速冷卻至40℃～60℃(某個退火溫度)的時候,可使引物和模板發生結合.由於模板DNA 比引物複雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高於模板互補鏈之間的碰撞,這就使PCR後期的過程成為可能.退火溫度與時間,取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度,還有靶基序列的長度.對於20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想.

另一種說法：熔解溫度（Tm）是引物的一個重要參數.這是當50％的引物和互補序列表現為雙鏈DNA分子時的溫度.Tm對於設定PCR退火溫度是必需的.在理想狀態下,退火溫度足夠低,以保證引物同目的序列有效退火,同時還要足夠高,以減少非特異性結合.合理的退火溫度從55℃到70℃.退火溫度一般設定比引物的 Tm低5℃.

設定Tm有幾種公式.有的是來源於高鹽溶液中的雜交,適用於小於18鹼基的引物.有的是根據GC含量估算Tm.確定引物Tm最可信的方法是近鄰分析法.這種方法從序列一級結構和相鄰鹼基的特性預測引物的雜交穩定性.大部分計算機程序使用近鄰分析法.

Tm值除了用軟件之外,還可以這個公式：2（A+T）+4（C+G）,然後減5—10度

根據所使用的公式及引物序列的不同,Tm會差異很大.因為大部分公式提供一個估算的Tm值,所有退火溫度只是一個起始點.可以通過分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性.開始低於估算的Tm5℃,以2℃為增量,逐步提高退火溫度.較高的退火溫度會減少引物二聚體和非特異性產物的形成.

為獲得最佳結果,兩個引物應具有近似的Tm值.引物對的Tm差異如果超過5℃,就會引物在循環中使用較低的退火溫度而表現出明顯的錯誤起始.如果兩個引物Tm不同,將退火溫度設定為比最低的Tm低5℃

或者為了提高特異性,可以在根據較高Tm設計的退火溫度先進行5個循環,然後在根據較低Tm設計的退火溫度進行剩餘的循環.這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝.

另外,由於PCR儀的不同,注意其退火溫度的設定：一般的PCR儀允許設置跨度12-15度的梯度範圍,所以你的梯度範圍儘可能設置寬一點,爭取一輪梯度就可以確定最佳可用退火溫度.

具體從多少度到多少度,要看你這對引物的Tm值,如果兩個引物Tm值不高,可以設置48-60的梯度；否則可以設置58-70度的梯度；如果兩個引物的Tm中等,則可以設置53-65的梯度範圍,具體情況靈活掌握.

傳統梯度PCR儀中是可以放置12個樣品進行梯度的,需要注意的是每個相鄰兩孔間的溫度差異是不等的,尤其是第2、3孔與第1孔接近,第10、11孔與第12孔接近.可以捨棄第2、2、10、11孔,只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8個樣品,孔間溫度變化幾乎呈真正的梯度狀.

退火溫度的溫度時間

退火溫度與時間，取決於引物的長度、鹼基組成及其濃度，還有靶基序列的長度。對於20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)復性溫度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允許範圍內， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合， 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。在金屬加工領域，退火溫度是指退火時金屬應加熱達到的溫度。據有關文獻介紹，不同金屬材料的退火溫度為：鉑，900—1000℃；銅，650℃；黃銅，600—650℃；鎳銀，650—680℃；鋁，283—350℃等。