目前為止較為常用的方法有通過化學合成，體外轉錄，長片斷dsRNAs經RNase III 類降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III)體外製備siRNA，以及通過siRNA表達載體或者病毒載體，PCR製備的siRNA表達框在細胞中表達產生siRNA。
工具/原料
靶mRNA,RNA聚合酶III
步驟/方法
化學合成
許多國外公司都可以根據使用者要求提供高質量的化學合成siRNA。主要的缺點包括價格高，定製週期長，特別是有特殊需求的。由於價格比其他方法高，為一個基因合成3—4對siRNAs 的成本就更高了，比較常見的做法是用其他方法篩選出最有效的序列再進行化學合成。
體外轉錄
以DNA Oligo為模版，通過體外轉錄合成siRNAs，成本相對化學合成法而言比較低，而且能夠比化學合成法更快的得到siRNAs。不足之處是實驗的規模受到限制，雖然一次體外轉錄合成能提供足夠做數百次轉染的siRNAs，但是反應規模和量始終有一定的限制。
而且和化學合成相比，還是需要佔用研究人員相當的時間。值得一提的是體外轉錄得到的siRNAs毒性小，穩定性好，效率高，只需要化學合成的siRNA量的1/10就可以達到化學合成siRNA所能達到的效果，從而使轉染效率更高。
用RNase III 消化長片斷雙鏈RNA製備siRNA
其他製備siRNA的方法的缺陷是需要設計和檢驗多個siRNA序列以便找到一個有效的siRNA。而用這種方法——製備一份混合有各種siRNAs “混合雞尾酒” 就可以避免這個缺陷。選擇通常是200—1000鹼基的靶mRNA模版，用體外轉錄的方法制備長片斷雙鏈dsRNA ，然後用RNase III (or Dicer) 在體外消化，得到一種siRNAs“混合雞尾酒”。在除掉沒有被消化的dsRNA後，這個siRNA混合物就可以直接轉染細胞，方法和單一的siRNA轉染一樣。由於siRNA混合物中有許多不同的siRNAs，通常能夠保證目的基因被有效地抑制。
siRNA表達載體
多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的髮夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以採用RNA pol III啟動子是由於它可以在哺乳動物細胞中表達更多的小分子RNA，而且它是通過新增一串（3到6個）U來終止轉錄的。要使用這類載體，需要訂購2段編碼短髮夾RNA序列的DNA單鏈，退火，克隆到相應載體的pol III 啟動子下游。由於涉及到克隆，這個過程需要幾周甚至數月的時間，同時也需要經過測序以保證克隆的序列是正確的。
siRNA表達框架
siRNA表達框架是一種由PCR得到的siRNA表達模版，包括一個RNA pol III啟動子，一段髮夾結構siRNA，一個RNA pol III終止位點，能夠直接匯入細胞進行表達而無需事前克隆到載體中。和siRNA表達載體不同的是，SECs不需要載體克隆、測序等頗為費時的步驟，可以直接由PCR得到，不用一天的時間。因此，SECs成為篩選siRNA的最有效工具，甚至可以用來篩選在特定的研究體系中啟動子和siRNA的最適搭配。如果在PCR兩端新增酶切位點，那麼通過SECs篩選出的最有效的siRNA後，可以直接克隆到載體中構建siRNA表達載體。構建好的載體可以用於穩定表達siRNA和長效抑制的研究。
注意事項
製備時，小心梅的耗損
篩選siRNA要用SECs