酵母能做什麼實驗?

酵母雙雜交實驗有哪些注意事項

注意事項

（1）酵母雙雜交對照的設定 常規的酵母雙雜交操作時一般會設定陽性對照、陰性對照以及顯色系統對照三種對照，以MATCHMAKER GAL4酵母雙雜交篩選系統為例：

陽性對照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中T蛋白和53蛋白是已經明確在酵母細胞內能夠發生結合並啟動報告基因表達的兩種蛋白。

陰性對照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已經明確T蛋白和lam蛋白在酵母細胞內不能發生結合。 系統顯色對照，pGADT7-Pcl1，該表達質粒轉入酵母細胞就能引起-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶的分泌，從而檢測顯色系統是否有問題。

（2）假陽性現象 多種原因可能造成假陽性結果，常見的有以下三種：

篩到的文庫蛋白自身具有轉錄活性，能夠啟動報告基因的表達——這種情況需要對篩到的候選蛋白進行自激活驗證。

酵母細胞內可能同時含有不止一種文庫蛋白，其中的一種文庫蛋白可以與誘餌蛋白相互及結合。

這種情況需要對陽性克隆再次劃板2~3次，以確保每一個酵母克隆中只含有一種文庫蛋白和誘餌蛋白；另外劃板的次數也不宜過多，否則會出現蛋白表達質粒丟失的情況。 其他一些不明原因造成的假陽性—這種情況需要將篩到的候選文庫質粒和表達誘餌蛋白的質粒重新共轉入酵母細胞或者通過酵母雜交的方式重新驗證，如有必要可以將pGADT7-cDNA質粒與pGBKT7-bait質粒的載體對調構建成pGADT7-bait與pGBKT7-cDNA並重新在酵母細胞中驗證，真正的陽性結合在對調以後也能在酵母細胞中做出陽性結果。

（3）常見的問題及參考方案 轉化效率過低—儘量使用新鮮的培養基以及新鮮的、且直徑大小在2~3 mm左右的酵母克隆，以確保酵母的活力；可將用於轉化的質粒在使用前進行乙醇沉澱，以提高質粒的純度和濃度。

雜交效率偏低—可能由於表達的融合蛋白對酵母細胞有毒性，在某些情況下在液體培養基中生長不好的酵母換到瓊脂糖固體培養板上時，會生長得比較好，這種情況可以採用共轉化的方法進行試驗；或者將單轉的酵母克隆分別鋪到5塊10 mm的培養板上，待克隆長出來以後，刮取所有克隆於5 mL 0.5×YPDA中。重懸後再按照常規雜交操作步驟進行操作。 背景過高—當使用HIS3作為報告基因時，由於HIS3基因具有一定程度的洩漏表達，可能會出現背景過高的情況，這時可以使用適量的HIS3蛋白競爭性抑制劑3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一種更加嚴格的報告基因的篩選如Ade。

誘餌蛋白具有自激活現象——可以採用克隆突變的方法將產生自激活一段氨基酸序列敲除或突變，但這種方法可能會破壞兩蛋白之間的相互作用。