載體構建摩爾比怎麼算?

General 更新 2024-11-08

如何計算目的基因和載體的摩爾比

2個目的基因如何導入一個載體.

基因操作過程中使用運載體有兩個目的：一是用它作為運載工具,將目的基因轉移到宿主細胞中去；二是利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量的複製（稱為克隆）.

攜帶外源DNA片段的質粒進入受體細胞後,停留在細胞中進行（自我複製）或整合到細菌擬核DNA中,隨著擬核DNA的複製而複製.

載體除了質粒以外,還有噬菌體載體、病毒載體等.

連接時載體和片段的摩爾比多少合適

跑膠估計就是用你的樣品，和DNA marker中已知量的條帶的亮度比例，來估算你的樣品的DNA樣品。這個需要一定的經驗。例如一般的1KB ladder，最亮的條帶在點樣3微升時為50ng，那麼你看你的條帶的亮度大約是ladder條帶亮度的10倍的話，你就知道你點的樣大約是500ng了。

比例的話儘量保持在10：1~3：1間，太少會降低連接效率，拿不到克隆，太高浪費，也會造成非預料的連接結果。

明白了麼？

怎樣刪除鏡像文件 10分

可以進到dos狀態下刪。也可以調出資源管理器。結束無關進程後再刪。如果是虛擬光驅裡用的鏡像文件可以先在虛擬光驅裡退出鏡像文件後再刪。

連接時候為什麼摩爾比要是1：3-1：10之間呢，原理

為了確保每一個載體都能連上一段目的片段，增加陽性率。

T載體如何製備

用限制性內切酶製備T載體

陸哲明,柯　楊△[北京大學臨床腫瘤學院(北京市腫瘤防治研究所)遺傳室,北京　100034]

[關鍵詞]T載體;DNA限制酶類;遺傳載體;基因擴增[摘　要]

目的:介紹一種製備T載體的方法。方法:用限制性內切酶XcmⅠ酶切,在兩端產生T末端,製備的T載體可直接用來克隆用TaqDNA聚合酶產生帶A末端的PCR產物。結果:PCR產物直接和T載體連接,用常規氯化鈣法制備的感受態菌轉化,對轉化子提取質粒進行酶切鑑定,證明陽性率達80%。結論:製備T載體過程簡單,質量穩定,產量高,並可擴增等優點。

[中圖分類號]Q342　　[文獻標識碼]A　　[文章編號]1671 167X(2002)06 0726 03

PCR是目前體外DNA擴增最常用的方法,對PCR產物進行快速有效的克隆是開展下游許多實驗所要求的。目前TA克隆是一種快速的,一步到位地把PCR產物直接插入到質粒載體的方法。而商品化的TA克隆系統由於售價高,質量批次間不穩定且無法進行循環使用等缺點,在實際應用中,限制了T載體的廣泛使用。本文介紹了一種簡單、高效,可在普通實驗室中製備並可反覆擴增的T載體制備方法,並經PCR產物克隆,酶切鑑定,得到了非常理想的結果。

1　材料與方法1

.1　製備SuperpGEM Teasy載體(簡稱pSP Teasy載體)1

.1.1　製備pSP Teasy環化載體　以線性化的pGEM Teasy載體(Promega為模板,兩邊設計引物:

F:GAATAAGCTTGTTCCCAGGTCAAGACTGGATCACTAGT

HindⅢ　　　　　　XcmⅠG

AATTCGCG

R:GAACAAGCTTATTCCCAGTCTAGACCTGGATCGAATTC

HindⅢ　　　　　　XcmⅠC

CGCGGCCGCCA

引物的5′端各插入HindⅢ和XcmⅠ位點,3′端與模板互補,在PfuDNA聚合酶的作用下擴增,擴增產物經HindⅢ酶切後,自身環化,挑選能被HindⅢ酶切的克隆即為陽性克隆,經測序進一步證實。

1.1.2　製備pSP Teasy線性化載體　按照標準酶切體系,用XcmⅠ(NEB)酶切,酶切產物經瓊脂糖凝膠電泳後,玻璃奶回收,測量吸光度值(D260),調整質量濃度至50mg·L-1,此載體可直接用於克隆。

3　討論PCR技術是目前體外擴增DNA最常用的方法。有時需得到克隆化的DNA以便於雜交分析、高質量測序及從複雜PCR產物中分離目的片段。常用的方法有非定向克隆和定向克隆。定向克隆需在引物5′端引入限制性內切酶位點,PCR產物經適當內切酶酶切後產生粘端,連接到相應載體。非定向克隆有兩種策略,一種是平末端克隆,在klenow和T4DNA聚合酶作用下修平PCR產物末端,但連接效率僅為粘端連接的1/50,且自身環化率高[1];另一種是TA克隆。TA克隆是一種快速的,一步到位的非定向克隆法,可以把PCR產物直接插入到質粒載體。TA克隆系統利用TaqDNA聚合酶的末端轉移酶活性,在擴增DNA3′末端非模板依賴地加上一個核苷酸,通常為腺苷酸[2]。這個3′A突出端被用於把PCR產物插入到插入位點有一個3′T突出端的載體。製備好的載體,其關鍵部分是帶有3′T突出端的線性分子。目前製備3′T載體的方法是先用平末端限制性內切酶(如EcoRⅤ)酶切載體,再用TaqDNA聚合酶在僅有dTTP的情況下,72～75℃反應,在3′末端添加一個T[1,3]。但是,實際反應過程中,由於3′末端加T為非優先聚合核苷酸,僅部......

連接體系中確定的載體與外源基因之間的摩爾比例關係是固定不變的嗎？

連接體系中確定的載體與外源基因之間的摩爾比例關係是固定不變的

可以為研究者提供研究的具體方法；可以為科學的新發現、新發明提供啟示和借鑑。因此現代科學研究中尤其需要注重科學方法論的研究和利用，這也就是我們要強調指出的一個問題。一、科學實驗法科學實驗、生產實踐和社會實踐並稱為人類的三大實踐活動。實踐不僅是理論的源泉，而且也是檢驗理論正確與否的惟一標準，科學實驗就是自然科學理論的源泉和檢驗標準。特別是現代自然科學研究中，任何新的發現、新的發明、新的理論的提出都必須以能夠重現的實驗結果為依據，否則就不能被他人所接受，甚至連發表學術論文的可能性都會被取締。