多聚半乳糖醛酸酶?

多聚半乳糖醛酸酶（PG），能降解果膠使細胞壁破損．番茄果實成熟中，PG合成顯著增加，能使果實交紅變軟，

（1）①已獲取PG的mRNA，可通過逆轉錄或cDNA文庫的方法獲得目的基因．②基因轉錄的產物是mRNA，在轉錄時需要RNA聚合酶．目的基因兩側的黏性末端如圖：③大腸桿菌繁殖快，因此將重組質粒轉化到大腸桿菌中的目的是大量複製目的基因（克隆目的基因）．（2）植物細胞在質量分數為25%的蔗糖溶液中會發生質壁分離現象，這可以用來鑑別細胞壁是否再生．（3）反義RNA一般是指與編碼鏈或有義鏈互補的DNA鏈編碼的RNA，mRNA是由編碼鏈或有義鏈編碼的RNA，所以反義RNA和mRNA分子能互補成雙鏈的RNA．由於核糖體不能翻譯雙鏈的RNA，所以反義RNA與mRNA特異性的互補結合，即抑制了該mRNA的翻譯；若轉基因番茄的保質期比非轉基因番茄長，則可確定轉基因番茄成功．（4）獲得的轉基因番茄產生的種子（是有性生殖的後代，會發生性狀分離）不一定保留目的基因，故要保持該優良性狀，可採用無性生殖即植物組織培養的方法．（5）改造過程需要的工具酶有限制酶和DNA連接酶；DNA連接酶分為E．coliDNA連接酶和T4DNA連接酶，這二者都能連接黏性末端，此外T4DNA連接酶還可以連接平末端．（6）基因表達載體的組成包括目的基因、啟動子、終止子、標記基因、複製原點；將目的基因導入植物細胞常用農桿菌轉化法．故答案為：（1）①逆轉錄（或cDNA文庫）②RNA聚合酶 ③大量複製目的基因（克隆目的基因）（2）是否發生質壁分離（3）天然PG基因轉錄的mRNA 長（4）植物組織培養（5）限制酶和DNA連接酶 T4DNA連接酶（6）啟動子、終止子、標記基因、複製原點 農桿菌轉化法

測定植物中多聚半乳糖醛酸酶的具體方法 10分

在可食的植物中，有許多蔬菜、水果含有果膠，果膠也是一種高分子化合物，化學組成如半乳糖醛酸。果膠水解後，產生果膠酸和果酸，果膠有一個重要的特性就是膠凝（凝凍）。測定方法有3種：重量法 、比色法 、容量法。

（一）重量法

1.原理：利用果膠酸鈣不溶於水的特性，先使果膠質從樣品中提取出來，再加沉澱劑使果膠酸鈣沉澱，測定重量並換算成果膠質重量。沉澱劑+果膠→果膠酸鈣

採用的沉澱劑有兩種：

電介質： Nacl Cacl2；

有機溶液：甲醇 乙醇 丙酮.

對於聚半乳糖醛酸酯化程度為20%時，水溶性差，易沉澱的果膠酸用Nacl為沉澱劑

對於聚半乳糖醛酸酯化程度為50%時，水溶性大，難沉澱的果膠酸用Cacl2為沉澱劑

對於聚半乳糖醛酸酯化程度為100%時，用有機溶劑為沉澱劑

這說明了聚半乳糖醛酸酯化程度大、水溶性就大，脂化程度會高，酒精濃度也應會大。

2.方法：

稱30-50g（幹樣5-10g）於250ml燒杯→加150ml水→煮沸1h（攪拌加水解免損失）→冷卻→定溶→250ml→抽濾→吸濾液25ml→於500ml燒杯→加0.1N NaOH 100ml→放30min→加50ml 1N 醋酸→加50ml 2N Cacl2→放1hr→沸騰5min後→用烘至恆重的濾紙過濾→用熱水洗至無Cl-→把濾紙+殘渣→於烘乾恆重的稱量瓶內→105℃烘至恆重

3.計算：

果膠質%=(0.9235×G)/( W×25/250) ×100

0.9235：果膠酸鈣換算成果膠質的等數

G：濾渣重量，g

W：樣品重量，g

（二）容量法（蒸餾滴定法）

1.原理

溶解於水的果膠質是由多縮阿拉伯糖和果膠酸鈣組成的測出果膠質的特徵部分阿拉伯糖，則可算出果膠質含量。

溴混合液在Hcl作用下放出溴，溴再與糠醛作用，剩餘的溴與碘化鉀作用析出碘，可用亞硫酸鈉滴定，從而計算糠醛的量。

2.步驟

稱搗碎樣10g→於250ml燒瓶中→加12% HCl 100ml（比重1.06）→接冷凝管並在瓶上接一個分液漏斗→於140-150℃水浴加熱蒸餾液取於量筒→餾液達30ml時→從漏斗加12% Hcl 30ml於燒瓶→繼續蒸餾→保持瓶內體積→至餾出液無糠醛（可取餾液1d於濾紙上，旁邊滴醋酸苯胺試液1d，有糠醛存在時呈紅色）

在餾液中加12% Hcl使總體積為300ml→取出100ml→加25ml 溴混合液→暗處放1hr→再加15% 碘化鉀10ml→澱粉指示劑1d→用0.1N 硫代硫酸鈉滴定

3.計算

果膠質=(N（V2-V1）×0.024×3.7)/W × 100

0.024：1N溴溶液1ml相當於糠醛的量，g

3.7：在普通蒸餾條件下，將糠醛換稱為果膠質的等數

W：樣品溶液相當於樣品的量，g

N：硫代硫酸鈉標液的當量濃度

V1：空白滴定硫代硫酸鈉標液消耗的體積，ml

V2：樣液硫代硫酸鈉標液消耗的體積，ml

（三）比色法

方法基於果膠物質水解，生成物半乳糖醛酸在強酸中與咔唑的縮合反應，然後對其紫紅色溶液進行比色定量測定。生成紫紅色物質與半乳糖醛酸濃度成正比

操作：

a.副作半乳糖醛酸標準曲線

b.提取樣品中果膠物質，定容100ml

c.測定吸光度，查曲線得半乳糖醛酸含量

果膠質總量%=(半乳糖醛酸（μg/ml）×100)/(樣品克數×10/200×10000)...