丙酮酸是在一元羧酸轉運酶(丙酮酸轉運酶)的幫助下進入線粒體，不需要消耗能量，相當於協助擴散丙酮酸通過自由擴散通過外膜；內膜是丙酮酸轉運酶協助擴散轉進去的。丙酮酸在有氧狀態下，進入線粒體中，丙酮酸氧化脫羧生成乙醯CoA進入三羧酸迴圈，進而氧化生成CO2和H2O，同時NADH+H+等可經呼吸鏈傳遞，伴隨氧化磷酸化過程生成H2O和ATP。
丙酮酸以何種運輸方式由細胞質基質進入線粒體？
線粒體的外膜(outmembrane)含40%的脂類和60%的蛋白質，具有孔蛋白（porin）構成的親水通道，允許分子量為5KD以下的分子通過，1KD以下的分子可自由通過。丙酮酸的相對分子質量只有90D，能夠自由通過線粒體外膜。
協同運輸（cotransport）是一類靠間接提供能量完成的主動運輸方式。物質跨膜運動所需要的能量來自膜兩側離子的電化學濃度梯度，而維持這種電化學勢的是鈉鉀泵或質子泵。
線粒體的內膜（innermembrane）含100種以上的多肽，蛋白質和脂類的比例高於3:1。線粒體內膜通透性很低，僅允許不帶電荷的小分子物質通過，大分子和離子通過內膜時需要特殊的轉運系統。丙酮酸通過線粒體內膜是利用H+梯度協同運輸的。