我們從構建好的大量抗體中篩選出候選抗體，然後要注入小鼠和食蟹猴體內，在不同時間點取血清，測定其中的抗體濃度，計算抗體的PK值，以進行進一步的抗體篩選。因此要進行大量的ELISA實驗。
工具/原料
試劑：1. 雙蒸水（實驗室製備） 2. 包被液：碳酸鹽緩衝液 Na2CO3 159mg NaHCO3 293mg ddH2O to 100ml 3. 1×PBS（實驗室配置） NaCl 8g KCl 0.2 KH2PO4 0.27g Na2HPO4 •12H2O 3.58g ddH2O to 1L 4. PBST（實驗室配置）：Adding 500ul Tween20 into 1L 1×PBS. 5. Blocking solution: 2% BSA BSA 2g 1×PBS to 100ml 6. BSA（Beyotime， Cat Number：ST023） 7. Antigen (PEPRO TECH, Cat:200-04R ), Dissolved in ddH2O and prepared 100ug/ml stocking solution. 8. Human Antibodies (Mammalian cell expressed) 9. secondary antibody(HRP conjugated)（Sino biotechnology, Cat: SSA002. Working solution：dilute secondary antibody at 1:2000 with 1% BSA . 10. TMB（Solarbio，Cat Number：PR1200） 11. 2M 硫酸（實驗室配置）
材料： 1. 15ml 離心管（Nunc） 2. 96-well ELISA 酶標板（Jetbio） 3. 300ul 多通道移液器（RAININ） 4. 10ul、200ul、1000ul 單通道移液器（RAININ） 5. 1.5ml 離心管
儀器： 1. 恆溫培養箱（上海一恆科學儀器有限公司） 2. 酶標儀（MD Flexstation3）
方法/步驟
方法：
1. 配製抗原包被液。
2. 將配好的抗原包被液加入到加樣槽中，使用12 channel pipette (使用前需用手將每一個tip頭壓緊) 加入96-well 酶標板中，每孔100ul。加樣時要注意避免氣泡並避免液體粘附於孔壁。加樣時使pipette的各個tip對準96-well一行中的各個孔，按照由B行至G行的順序，逐行加入。
1. 將96-well酶標板用保鮮膜包裹（或加蓋）後， 4℃ 冰箱中孵育過夜。
2. 第二天，將96-well 板取出，棄其中溶液，並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
3. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入1×PBS，每孔300ul。
4. 室溫靜置3min，棄溶液，並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
5. 重複步驟5和6，共計三次。
6. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入Blocking solution，每孔300ul。
7. 將酶標板用保鮮膜包裹（或加蓋）後，置於37℃恆溫培養箱中孵育1h。(37℃ or lower?)
8. 將96-well 板取出，棄其中溶液，並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
9. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入PBST，每孔300ul。
10. 室溫靜置3min，棄溶液，並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
11. 重複步驟11和12，共計5次。 重複步驟5和6，共計2次。
12. ※將稀釋好的抗體依次加入到相應的孔中，每個樣品做三個復孔，每孔100ul。(加樣方法，方向如下。)
1. 將酶標板用保鮮膜包裹（或加蓋）後，置於37℃恆溫培養箱中孵育1h。
2. 將96-well 板取出，棄其中溶液，並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
3. 重複步驟11和12，共計5次。 重複步驟5和6，共計2次。
4. 使用12-channel pipette(用手將每一個tip頭壓緊)向96-well 板中按照加抗原包被液的方式逐排加入二抗working solution，每孔100ul。
5. 將酶標板用保鮮膜包裹（或加蓋）後，置於37℃恆溫培養箱中孵育1h。
6. 將96-well 板取出，棄其中溶液，並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
7. 重複步驟11和12，共計5次。 重複步驟5和6，共計2次。
8. 確保環境溫度為25℃，使用12-channel pipette(用手將每一個tip頭壓緊) 按照加抗原包被液的方式，向96-well 板中逐排加入TMB溶液，每孔100ul。
9. 25℃下，保溫3min，立即使用12-channel pipette(用手將每一個tip頭壓緊) 按照加抗原包被液的方式，向96-well板中加入2M H2SO4 溶液終止反應。
10. 靜置5min後，將96-well板置於FlexStation III 於450nm檢測讀數。 (在FlexStation III的工作站軟體中選擇Endpoint/HRP-TMB 方法)
※ 抗體稀釋方法：
Prepare 0.1ug/ml antibody solution；
Then to prepare antibody working solution as below：
注意事項
使用12 channel pipette (使用前需用手將每一個tip頭壓緊);