分子克隆技術論文

　　克隆這個詞出現於20世紀初，其含義指由單個祖先個體經過無性繁殖而產生的其他個體。下面小編整理了，歡迎閱讀!

　　篇一

　　水稻粒型基因克隆與分子育種研究進展

　　摘要：水稻***Oryza sativa L.***粒型包括粒長、粒寬和長寬比，既是水稻外觀品質之一，又通過影響粒重而影響產量，因此改良水稻粒型具有十分重要的意義。隨著功能基因組和分子標記技術的發展，越來越多的粒型基因被克隆，部分已經開始應用於育種實踐。綜述了水稻粒型基因的克隆、粒型基因之間的相互關係及其在分子育種中的應用。以期為水稻育種提高產量和改良品質提供理論依據。

　　關鍵詞：水稻***Oryza sativa L.***;粒型;基因克隆;分子育種

　　中圖分類號：S511;Q785 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114***2014***13-2977-04

　　Cloning and Molecular Breeding of Grain Shape Genes of Rice

　　QIU Xian-jin1，YUAN Zhi-hua1，HE Wen-jing1，LIU Huan1，XU Jian-long1，2，XING Dan-ying1

　　***1. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou 434025， Hubei， China;

　　2. Institute of Crop Science， Chinese Academy of Agriculture Sciences， Beijing 100081， China***

　　Abstract： Rice***Oryza sativa L.*** grain shape including grain length， grain width， and length to width ratio is an important appearance quality and a factor affecting rice grain weight. With the development of functional genomics and moleculars markers in last decades， a number of grain shape genes have been cloned and used in molecular breeding of rice. This paper reviews the cloning of grain shape genes， the relationship amang these genes， and their applications in molecular breeding of rice. It will provide useful information for improving yield and quality of rice.

　　Key words： rice***Oryza sativa L.***; grain shape; gene cloning; molecular breeding

　　水稻***Oryza sativa L.***是世界上最重要的糧食作物之一，是世界一半以上人口的主食，也是我國2/3以上人口的主食[1]。隨著我國人口的不斷增長和耕地面積的逐漸減小，糧食安全日益受到人們的重視[2，3]。從20世紀50年代開始，矮化育種和***優勢利用使我國水稻單產大幅增長[4，5]。但是近20年來，我國水稻產量徘徊不前，迫切需要新的育種方法和技術來提高水稻產量[6]。水稻三因子中，粒重受環境影響最小，增加粒重對提高水稻單產具有十分重要的意義。

　　另外，隨著我國人民生活水平的不斷提高，人們對水稻品質的要求也越來越高。如何將提高產量和改良品質有機地結合起來是育種家們要解決的重大課題。

　　粒型包括粒長、粒寬和長寬比，是水稻重要的外觀品質，同時也通過影響粒重對水稻產量有很大影響[7]。此外，粒型與外觀品質、加工品質、蒸煮食味品質也有十分密切的關係[8]。因此克隆水稻粒型基因，開發相應的分子標記，通過分子育種改良水稻粒型，可以同時提高水稻產量和改良水稻品質。本文從水稻粒型基因的克隆、粒型基因之間的相互關係和在分子育種中的應用等方面，綜述了前人在粒型性狀遺傳與育種方面的研究成果，以期為水稻育種提高產量和改良品質提供參考依據。

　　1 水稻中已克隆的粒型基因

　　水稻粒型基因克隆有利於人們瞭解粒型性狀的發育過程和分子機制，幫助育種家進行育種改良。隨著功能基因組學和分子標記技術的發展，近年來研究者們用遺傳群體和突變體的方法克隆了許多粒型基因。

　　GS3是第一個克隆的粒型基因，它主要影響粒長、長寬比和粒重。Wan等[9]利用Asominori/IR24構建的重組自交系將其定位到87.5 kb區間，後來Fan等[10]利用川7/明恢63構建的回交群體將它精細定位於7.9 kb區間。GS3含有5個外顯子和4個內含子，編碼一個含有3個結構域的跨膜蛋白，其中OSR結構域是粒長變短的必需結構域，而VWFC結構域在水稻生長髮育過程中對OSR結構域起抑制作用[11]。GS3第二個外顯子上的一個C突變成A是導致短粒變成長粒的根本原因，此外還有兩個SSR位點對粒長有影響[10-12]。GS3進化起源於粳稻，在進化歷程中滲透到秈稻中[13]。在漫長的馴化過程中，GS3受到了強烈的正向選擇。

　　GW2是第一個克隆的影響粒寬和粒重的主效基因，含有8個外顯子和7個內含子，編碼一個具有E3泛素連線酶活性的蛋白[14]。GW2在水稻中組成型表達，2個親本的表達量沒有差異，揭示2種等位基因對粒寬影響的差異不是表達量的高低，而是翻譯蛋白功能的喪失，這與GS3很類似。窄粒等位基因由於一個點突變造成提前終止，編碼的蛋白失去功能，細胞數目增加，灌漿速度加快，最終導致穀粒變寬。WY3***研究所用窄粒親本***等位基因是一種稀有等位基因，在中國的核心種質中含有這種等位基因的水稻品種很少[15]。 　　qSW5/GW5也是一個影響粒寬和粒重的主效基因，它通過影響穎殼細胞數目影響粒寬[16]。qSW5含有一個功能位點***Functional nucleotide polymorphisms，FNP***，日本晴的等位基因有1 212 bp的缺失。關聯分析結果表明，這段缺失與粒寬存在高度關聯，且在馴化過程中受到了選擇。qSW5/GW5編碼一個含有144個氨基酸的蛋白質，具有核定位訊號和一個富含精氨酸的結構域，亞細胞定位顯示qSW5/GW5定位於細胞核內。qSW5/GW5可以與泛素互作，通過參與蛋白質降解途徑來影響粒寬[17]。qSW5/GW5負調控粒寬。

　　GS5也是一個影響粒寬和粒重的主效基因，編碼一個含有480個氨基酸的絲氨酸縮肽酶。關聯分析顯示該基因的啟動子區與粒寬有關聯，轉基因驗證也表明GS5通過表達量的變化來控制粒寬[18]。GS5正調控CDKA1、CAK1、CAK1A、CYCT1和H1這5個基因，在細胞週期中起到起始細胞分裂的作用，通過影響穎殼細胞數目來影響粒寬。與qSW5/GS5不同的是，GS5正調控粒寬。

　　與GS5相似，GW8也正調控粒寬和粒重[19]。GW8是OsSPL16，含有3個外顯子和2個內含子，影響粒寬的功能區域也是啟動子區而非編碼區。GW8在組織的發育過程中表達，尤其是在7 cm穗部表達量最高。GW8通過調控細胞週期基因CDKA1、CYCD3和E2F2的表達來影響穎殼細胞數目，最終影響粒寬。在核心種質中對該基因測序發現，窄粒等位基因比寬粒等位基因品質好，因此通過GW8的選擇可以同時降低粒寬和改良外觀品質。

　　GIF1編碼一個細胞壁蔗糖轉化酶，該基因突變使堊白增加，粒寬變寬[20]。FLO2含有一個三角形四肽結構域，可能介導蛋白質互作[21]。FLO2突變導致粒長變短，粒寬變窄。SRS3含有12個外顯子和11個內含子，編碼蛋白激酶13亞家族的一個蛋白[22]。這個基因突變導致粒型變得短圓，粒重下降。DEP2/EP2/SRS1編碼一個功能未知的植物特有蛋白，主要在幼嫩組織中表達，且在幼穗中表達量最高[23-25]。該基因主要影響穗軸及一次和二次枝梗的伸長，不影響穗原基的發生，並通過影響穎殼細胞形狀而非細胞數目而最終影響粒型。該基因突變後，穗部直立，粒型變得短圓。SRS5基因編碼α微管蛋白，在水稻中為組成型表達，但是在幼穗中表達量最高，並隨著幼穗的發育其表達量上升，通過影響穎殼細胞的長度來影響粒型[26]。EP3編碼一個含515個氨基酸組成的F結構域蛋白突變後導致穗長、分櫱數、每穗穎花數、育性、長寬比減小，但增加了最小維管束的數量和穗軸的厚度[27]。PGL1和PGL2都編碼bHLH蛋白，都是通過抑制ANTAGONIST OF PGL1***APG***的表達發揮作用，而APG基因是水稻粒型的負調控因子。超表達這兩個基因後，穎殼細胞長度增加，粒長和粒重增加[28，29]。

　　2 粒型基因之間的關係

　　目前已經克隆了一些粒型基因，它們的克隆為分子標記輔助選擇提高水稻產量和改良品質提供了非常大的幫助。但是，由於上位性作用，聚合這些基因的結果很難預測。因此，除了克隆粒型新基因，瞭解粒型基因的分子機理外，還需要弄清楚哪種等位基因最有利，以及各個基因之間的相互關係。

　　Yan等[30]分別構建GS3 RNAi轉基因材料、GW2 RNAi轉基因材料和以Habataki為供體，Sasanishiki為受體的qSW5的染色體片段代換系三套遺傳材料，用來驗證這3個基因的功能，同時探究它們之間的相互關係。結果表明，在調控路徑上GW2位於qSW5基因的上游，同時和qSW5一起正調控GS3，GIF1受GS3和GW2負調控以及qSW5正調控，且GS3和qSW5不同等位基因之間的效應會相互掩蓋。該研究較系統地描述了粒型主效基因之間的相互關係，為後續分子標記輔助選擇聚合粒型基因提高產量和改良品質提供了理論基礎。

　　3 粒型基因在分子育種中的應用

　　目前，水稻中克隆的粒型基因越來越多，為育種家提供了豐富的基因資源。其中GS3、GW5/qSW5、GS5和GW8被證實在水稻馴化歷程中受到了嚴格的選擇與淘汰。在水稻常規育種中已經廣泛地使用了這些基因，目前很多育成品種的粒型都得到了很大的改良。但是，這種育種方法沒有針對性，延長了育種年限，降低了育種家選出優良品種的機率。因此，在水稻育種中，開發這些基因的功能標記，針對這些基因進行分子育種，將會加快育種進度，便於育種家更快速有效地選擇到理想的品種。

　　Fan等[31]針對GS3的功能位點***C/A***設計了一個CAPs標記，並用該標記分析了180份核心種質，該標記能很好地區分GS3的兩種等位基因。Ramkumar等[32]也針對該位點設計了一個基於PCR的引物。該標記極大地降低了成本，可以用於較大規模地篩選目標基因。Wang等[12]又在GS3的第四個外顯子和第五個內含子處發現了2個與粒長相關的位點，並針對這2個位點設計了相應的標記。Yan等[33]根據GW2基因中1 bp的缺失設計了一個dCAPs標記，研究者也根據GW5/qSW5基因的1.2 kb缺失開發了功能標記[16，17，30]。這些標記的開發，都為分子育種選擇粒型提供了標記的基礎。

　　楊梯豐等[34]用以華粳秈74為受體、IR64為供體的單片段代換系，分析了GS3在單片段代換系下的遺傳效應及與其他幾個千粒重、粒寬、香味和抽穗期基因的聚合效應。結果表明，IR64的GS3匯入到華粳秈74後，無論是單片段代換系還是聚合材料，粒長均增加，說明來源於IR64的GS3能夠表現出增加粒長的效應。同時，其他幾個基因不會對GS3產生上位性效應，GS3的基因效應在代換系和聚合材料中都能穩定表達。

　　張劍霞[35]用分子標記輔助選擇的方法將長粒型等位基因的GS3和Xa23聚合到珍汕97B中，使粒長由原來的8.0 mm增長到9.81 mm，改良的效果十分明顯。Wang等[36，37]分別將93-11的GS3和qHD8、qGHD7、qHD6.1、Wx和一個控制葉形的QTL***qFL1***匯入到珍汕97B中，並進行基因聚合來改良珍汕97B的農藝性狀。結果表明，改良後的珍汕97B粒長由原來的8.3 mm增加到9.2 mm，粒寬由原來的3.2 mm減小到2.9 mm，千粒重由原來的25.2 g增加到27.2 g。Wang等[19]將窄粒型等位基因的GW8與長粒型等位基因的GS3聚合到HJX74中，結果粒長增長，粒寬減小，產量基本不變，培育出了一個新品種Huabiao1。 　　4 展望

　　我國水稻育種經歷了綠色革命和***優勢利用這兩個大的革新，水稻單產有了非常大的提高。但是隨著人口的增長，水稻產量還需要進一步提高。同時，隨著人們生活水平的提高，稻米品質越來越受到人們的重視。為了在提高單產的同時能改良水稻品質，水稻粒型的改良是最直接簡單的方法。隨著功能基因組和分子標記技術的發展，研究者們克隆了越來越多的粒型基因，未來將會有更多粒型基因得到克隆，它們的分子機理也會得到進一步闡明。

　　目前水稻粒型分子育種中只有GS3得到了廣泛應用，大部分粒型基因的利用目前僅限於傳統育種，主要原因是針對這些基因的功能標記技術還有待開發，或者是開發出來的功能標記技術使用成本較高。相信在不久的將來，研究者們會開發出更多更好的功能標記技術，粒型育種將會更加快速簡便。

　　另外，隨著越來越多粒型基因的定位與克隆，人們面臨的另一個問題是如何更加有效地選擇和利用這些基因。弄清粒型基因之間的相互關係，粒型基因對其他性狀的影響也是一個很重要的議題。搞清楚這些基因的關係，從中選擇最優良的基因進行粒型育種，也能極大地縮短育種程序，增加選育出優良品種的機率，提高育種效率。

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