實驗概要
本實驗介紹了根癌農桿菌介導的植物轉化－葉盤轉化法的原理及操作步驟。瞭解根癌農桿菌介導的植物基因轉化的方法和用途，掌握葉盤轉化法的基本原理和操作。
實驗原理
以根癌農桿菌介導的遺傳轉化是目前最有效的途徑之一。根癌農桿菌對植物釋放的化學物質產生趨化反應，向植物受傷組織集中。經共培養後，受傷部位的化學誘導物透過農桿菌的細胞膜使Ti質粒上的Vir基因活化。Vir基因產物使Ti質粒上的T－DNA進入植物細胞，並整合到植物核基因組中。插入在T－DNA左右邊界區內的目的基因也隨之整合到植物染色體上，從而使目的基因在植物細胞中得到表達。
工具/原料
主要試劑
1. YEB液體培養基
2. 抗菌素儲備液(Kan，Cif，Rif，Amp)
3. MS基本培養基
4. MS分化培養基
5. 70％乙醇
6. 0.1%昇汞
主要裝置
1. 超淨工作臺2. 27℃恆溫搖床3. 無菌小培養皿
實驗材料
1. 菸草、甘藍無菌苗或田間生長的植株2. 含目的基因的共整合載體或雙元載體的根癌農桿菌
方法/步驟
取幼嫩健康的葉片，用蒸餾水沖洗一遍，70％乙醇洗45秒，0.1%昇汞消毒6－8分鐘，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸乾水分。
將無菌葉片剪成份0.5cm×0.5cm的小塊，葉片近軸面向下，接種在愈傷組織誘導或分化培養基上，預培養2－3天。
挑取一個單菌落根癌農桿菌，接種到20ml附加相應抗生素的YEB培養液中，在27℃恆溫搖床上培養到OD值為0.6-0.8。取上述上培養物按1％－2％的比例，轉入新鮮的無抗菌素的YEB培養液中，繼續培養6小時，當OD值為0.2-0.5時即可用於轉化。
在超淨工作臺上，將菌液倒入無菌小培養皿，從培養液中取出預培養的外植體，放入菌液中泡1－5分鐘。取出外植體在無菌濾紙上吸去附著的菌液。然後接種在愈傷組織誘導或分化培養基（菸草的培養基為MS附加IAA0.5mg/L，BA2.0mg/L）上，28℃暗培養2－4天。
將經過共培養的外植體轉移到加有選擇壓的脫菌分化和愈傷組織誘導培養基上。在光照的條件下，25℃進行選擇培養。
選擇培養2－3周後，外植體的轉化細胞將分化出抗性不定芽，或者產生抗性愈傷組織。將這些抗性材料轉移到相應繼代選擇培養基上，或者轉入附加選擇壓的生長和分化培養基中，令其生長和誘導分化。
待不定芽長到1cm以上時，切下並插入含有選擇壓的生根培養基上進行根培養，兩週左右長出不定根。
注意事項
培養材料的選擇，需要選擇生長較好的材料。
植物材料的滅菌，要根據不同的材料來確定，材料允許的話，可以設計實驗取得最佳的滅菌處理。
培養基的配置。要根據不同的材料，不同的物種，選擇合適的培養基，最好有一組實驗取得。做培養基的過程中注意調劑培養基的PH值，有些高溫分解的激素要過濾滅菌等。
培養條件的選擇，包括光照、溫度、溼度等。