我們從構建好的大量抗體中篩選出候選抗體,然後要注入小鼠和食蟹猴體內,在不同時間點取血清,測定其中的抗體濃度,計算抗體的PK值,以進行進一步的抗體篩選。因此要進行大量的ELISA實驗。
工具/原料
試劑:1. 雙蒸水(實驗室製備) 2. 包被液:碳酸鹽緩衝液 Na2CO3 159mg NaHCO3 293mg ddH2O to 100ml 3. 1×PBS(實驗室配置) NaCl 8g KCl 0.2 KH2PO4 0.27g Na2HPO4 •12H2O 3.58g ddH2O to 1L 4. PBST(實驗室配置):Adding 500ul Tween20 into 1L 1×PBS. 5. Blocking solution: 2% BSA BSA 2g 1×PBS to 100ml 6. BSA(Beyotime, Cat Number:ST023) 7. Antigen (PEPRO TECH, Cat:200-04R ), Dissolved in ddH2O and prepared 100ug/ml stocking solution. 8. Human Antibodies (Mammalian cell expressed) 9. secondary antibody(HRP conjugated)(Sino biotechnology, Cat: SSA002. Working solution:dilute secondary antibody at 1:2000 with 1% BSA . 10. TMB(Solarbio,Cat Number:PR1200) 11. 2M 硫酸(實驗室配置)
材料: 1. 15ml 離心管(Nunc) 2. 96-well ELISA 酶標板(Jetbio) 3. 300ul 多通道移液器(RAININ) 4. 10ul、200ul、1000ul 單通道移液器(RAININ) 5. 1.5ml 離心管
儀器: 1. 恆溫培養箱(上海一恆科學儀器有限公司) 2. 酶標儀(MD Flexstation3)
方法/步驟
方法:
1. 配製抗原包被液。
2. 將配好的抗原包被液加入到加樣槽中,使用12 channel pipette (使用前需用手將每一個tip頭壓緊) 加入96-well 酶標板中,每孔100ul。加樣時要注意避免氣泡並避免液體粘附於孔壁。加樣時使pipette的各個tip對準96-well一行中的各個孔,按照由B行至G行的順序,逐行加入。
1. 將96-well酶標板用保鮮膜包裹(或加蓋)後, 4℃ 冰箱中孵育過夜。
2. 第二天,將96-well 板取出,棄其中溶液,並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
3. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入1×PBS,每孔300ul。
4. 室溫靜置3min,棄溶液,並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
5. 重複步驟5和6,共計三次。
6. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入Blocking solution,每孔300ul。
7. 將酶標板用保鮮膜包裹(或加蓋)後,置於37℃恆溫培養箱中孵育1h。(37℃ or lower?)
8. 將96-well 板取出,棄其中溶液,並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
9. 使用12-channel pipette向96-well 板中逐排加入PBST,每孔300ul。
10. 室溫靜置3min,棄溶液,並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
11. 重複步驟11和12,共計5次。 重複步驟5和6,共計2次。
12. ※將稀釋好的抗體依次加入到相應的孔中,每個樣品做三個復孔,每孔100ul。(加樣方法,方向如下。)
1. 將酶標板用保鮮膜包裹(或加蓋)後,置於37℃恆溫培養箱中孵育1h。
2. 將96-well 板取出,棄其中溶液,並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
3. 重複步驟11和12,共計5次。 重複步驟5和6,共計2次。
4. 使用12-channel pipette(用手將每一個tip頭壓緊)向96-well 板中按照加抗原包被液的方式逐排加入二抗working solution,每孔100ul。
5. 將酶標板用保鮮膜包裹(或加蓋)後,置於37℃恆溫培養箱中孵育1h。
6. 將96-well 板取出,棄其中溶液,並在潔淨的紙巾上輕輕拍幹。
7. 重複步驟11和12,共計5次。 重複步驟5和6,共計2次。
8. 確保環境溫度為25℃,使用12-channel pipette(用手將每一個tip頭壓緊) 按照加抗原包被液的方式,向96-well 板中逐排加入TMB溶液,每孔100ul。
9. 25℃下,保溫3min,立即使用12-channel pipette(用手將每一個tip頭壓緊) 按照加抗原包被液的方式,向96-well板中加入2M H2SO4 溶液終止反應。
10. 靜置5min後,將96-well板置於FlexStation III 於450nm檢測讀數。 (在FlexStation III的工作站軟體中選擇Endpoint/HRP-TMB 方法)
※ 抗體稀釋方法:
Prepare 0.1ug/ml antibody solution;
Then to prepare antibody working solution as below:
注意事項
使用12 channel pipette (使用前需用手將每一個tip頭壓緊);